RESEARCH OF THE BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF HYDROCARBON-OXIDIZING BACTERIA FROM OIL-POLLUTED SOILS OF THE UZEN OIL FIELD

Full Text

Введение

Одной из важнейших экологических проблем Мангистауской области являются негативные последствия нефтедобычи в регионе: выбросы нефти в процессе бурения скважин, техногенные аварии на месторождении с возникновением открытых фонтанов, разливы при транспортировках, течь в нефтепроводах и прочее. Попадая таким образом в окружающую среду нефть способствует загрязнению литосферы, гидросферы и атмосферы.

Нефть, попавшая в грунт, становится причиной нарушения физико-химических свойств почвы, нарушается естественная гидратация и аэрация почвы, что приводит к нарушению или даже гибели экосистем. Загрязненный грунт может служить источником вторичного загрязнения: испарение нефти приводит к попаданию в воздух токсичных соединений при этом в почве остаются наиболее сложные высокомолекулярные соединения, при этом отдельные фракции способны просачиваться в глубину грунта. Это приводит к заражению токсинами грунтовые воды, которыми могут быть разнесены на большие расстояния и попадать в моря, реки и озера, что приводит к отравлению природных экосистем, нарушая их естественное функционирование. Потенциальную опасность для живых организмов также представляет накопление в них полициклических ароматических соединений нефти, которые имеют канцерогенное и мутагенное влияние [1].

В настоящее время применяется ряд мероприятий для ликвидации разливов нефти и нефтепродуктов, а именно термические, механические, химические и биологические методы [2]. Одним из наиболее эффективных и экологически безопасных методов является биологическая рекультивация загрязненных грунтов, которая подразумевает применение методов биостимуляции, предполагающих активацию аборигенной микрофлоры обрабатываемых грунтов и методов биоаугментации, основанных на применении бактериальных препаратов на основе углеводородокисляющих бактерий.

Мангистауская область характеризуется резко континетальным и засушливым климатом, продолжительным и жарким летом (температура может достигать 42-47 ℃). Осадков выпадает крайне мало и преимущественно в теплое время года. Средне годовое количество осадков не превышает 130-180 мм. Почва представлена солончаками с содержанием соли до 2-4%, с очень низким содержанием влаги и органических соединений. Особенности региона способствуют формированию уникальной микрофлоры почв, а попадание в почву нефти и нефтепродуктов стимулирует бактерии к развитию специфических свойств, таких как устойчивость к токсичным соединениям нефти и способность к окислению ее компонентов [3].

Поскольку проблема углеводородного загрязнения окружающей среды в настоящее время имеет колоссальные масштабы, охватывая все регионы с нефтедобывающей отраслью, поиск и изучение новых УОБ является в настоящее время сферой фокусировки фундаментальных и прикладных исследований с различной спецификацией.

Настоящая работа посвящена изучению углеводородокисляющей микрофлоры высокоминерализованных, загрязненных нефтью грунтов месторождения Узень, а также поиску наиболее активных УОБ и исследованию их прикладного потенциала.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектами исследований были образцы нефти и нефтезагрязненных грунтов, отобранные на м.Узень. Образцы грунта отбирали стерильно в чашки Петри и хранили в холодильнике при 4°С.

Нефтезгагрязненный грунт имел комковатую структуру, обильно пропитанную нефтью, цвет варьировал от светло- до темно-коричневого цвета. Некоторые образцы характеризовались глинистой структурой.

 

Микробиологические методы

Накопительные культуры УОБ получали путем инкубирования образцов нефтезагрязненного грунта в аэробные жидкие среды с минерализацией 20 и 55 г/л. В 100 мл среды вносили 1 г образца грунта и 1 мл нефти. Культивирование проводилось при 40°С в стационарном состоянии и на шейкере (100 об/мин) в течение 5-10 суток.

Для культивирования УОБ применялась среда следующего состава (г/л): K2HPO4 – 1,5; KH2PO4 – 0,75; NH4Cl – 1; NaCl – 20; KCl – 0,1; MgSO4 х H2O – 0,1; CaCl2 х H2O – 0,02. Насыщенным раствором NaОН или 10% раствором НCl доводили рН среды до 7.

Через 12 суток произвели пересев наиболее активных накопительных культур на свежие жидкие питательные среды. На 13 сутки провели микроскопирование образцов грунта.

Для выделения чистых культур наиболее активные накопительные культуры из жидкой среды пересеяли на плотные питательные среды с нефтью. При этом использованы среды с минерализацией 20 и 55 г/л, состав которых приведен выше, с добавлением агар-агара (20 г/л). На плотные питательные среды в чашках Петри вносили нефть и распределяли стерильным шпателем по поверхности. Затем 0,1 мл посевного материала вносили в чашки и распределяли методом истощающего штриха. Чашки культивировали в термостате в течение 5-7 суток при 40°С. Затем из отдельных колоний производили пересев на чистую плотную питательную среду с нефтью, с целью выделения чистых культур. Далее проводили микроскопирование чистых культур.

 

Химические методы

Приготовление водной вытяжки из почвы. Пробы почвы массой 30 г. взвешенные с погрешностью не более 0,1 г, помещали в конические колбы. К пробам приливали по 150 мл дистиллированной воды. Почву с водой перемешивали в течение 3 мин и оставляли на 5 мин для отстаивания [4].

 

Измерение рН почвы. Для измерения рН почвы также готовили водную вытяжку из почвы. При этом часть почвенной суспензии, полученной из водной вытяжки, объемом 15—20 мл сливали в химический стакан вместимостью 50 мл и использовали для измерения pH.

Настройку pH-метра проводили по трем буферным растворам с pH 4.01. 6,86 и 9.18, приготовленным из стандарт-титров. Показания прибора считывали не ранее чем через 1,5 мин после погружения электродов в измеряемую среду, после превращения дрейфа измерительного прибора. Во время работы настройку прибора периодически проверяли по буферному раствору с pH 6,86 [4].

 

Определение ионов карбоната и бикарбоната. Для определения ионов карбоната и бикарбоната отбирали пипеткой 20 мл водной вытяжки в химический стакан и помещали стакан на магнитную мешалку. Бюретку заполняли раствором серной кислоты концентрации 20 моль/мл. В пробу вытяжки погружали электродную пару и кончик дозирующей трубки бюретки. Пробу титровали до pH 8,3 и регистрировали расход кислоты. Затем продолжали титрование до 4,4. По окончании титрования регистрировали расход кислоты по бюретке. Массовую долю карбонат-иона и бикарбонат-иона вычисляли расчетным методом [5].

 

Определение иона хлорида аргентометрическим методом по Мору. Ионы хлорида титровали в водной вытяжке раствором азотнокислого серебра, который образует с ионом хлорида труднорастворимое соединение. Для установления конечной точки титрования в раствор добавляли хромат калия, который образует с избытком серебра осадок, вызывающий переход окраски раствора от желтой к красно-бурой [6].

 

Весовое определение иона сульфата. Ионы сульфата осаждали раствором хлористого бария и взвешивали прокаленный остаток. Для предотвращения осаждения карбоната, фосфата бария и других соединений анализируемую пробу подкисляли соляной кислотой [7].

 

Определение ионов натрия. С помощью пламенного фотометра определяли интенсивность излучения атомов определяемого элемента. Натрий определяют по аналитическим линиям 589,0 и 589,9 нм [8].

 

Определение кальция и магния комплексонометрическим методом. Ионы кальция последовательным комплексонометрическим методом титровали при pH 12,5 — 13 и ионы магния при pH около 10 с использованием хрома кислотного темно-синего в качестве металлоиндикатора [9].

 

Аналитические методы

Экстракция и разделение нефти на фракции. В 100 мл культуральной жидкости вносили 10 мл н-гексана, которым отмывали нефть со стенок колб и экстрагировали остатки нефти с поверхности жидкой среды. Через 10 минут отбирали 5 мл верхней безводной фракции углеводородов. С помощью делительной колонки с силикагелем очищали нефть от механических примесей. Гексан служил подвижной фракцией при фильтрации. Отфильтрованные образцы оставляли при комнатной температуре для полного выпаривания гексана, после чего анализировали на ИК-Фурье спектрометре Agilent Cary 630 FTIR (США) в спектральном диапозоне ZnSe 4000–600 см-1.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

 

Результаты исследования физико-химических свойств нефтезагрязненных грунтов

Химический анализ позволил выявить во всех образцах грунта высокое содержание ионов кальция и сульфата. Образец 4737 характеризовался также высоким содержанием натрий- и хлорид-ионов. В целом, образец 4727 имел наибольшую минерализацию среди анализируемых образцов, около 5%. Все образцы имели слабощелочное значение рН (Таблица 1).

 

 

Таблица 1. Физико-химические свойства образцов грунта

 

№	Наименование показателя	Единица измерения	Образец 4375	Образец 5012	Образец 4737
1.	Натрий-ион	Ммоль в 100 г почвы	17,8	6,8	59,9
2.	Магний-ион		2,8	1,8	4,5
3.	Кальций-ион		29,0	41,0	47,8
4.	Сульфат-ион		14,0	10,4	22,2
5.	Хлорид-ион		7,7	12,2	35,5
6.	Бикарбонат ионы		1,3	1,1	1,1
7.	Карбонат ионы		Не обн.	Не обн.	Не обн.
8.	Суммарная минерализация	Мг-экв/100 г почвы	2049,0	1997,9	4783,1
9.	рН водной вытяжки		7,5	7,6	7,6

 

 

Результаты стационарного культивирования

При стационарном культивировании наблюдалось образование бактериальной пленки на границах фаз нефти-воды. Пленка грязно белого цвета, хорошо сохраняла структуру и разрушалась при взбалтывании.

Накопительная культура 4737 на 20 г/л визуально оказывала наиболее значительное влияние на нефть: нефть хорошо смывалась со стенок, наблюдалось образование мелкодисперсной фракции нефти и остатки неокисленной нефти (Рисунок 1).

 

 

Рисунок 1. Накопительная культура 4737, полученная на питательной среде с минерализацией 20 г/л. Инкубирование в течение 7 суток при 40 ℃

 

 

При визуальной оценке накопительных культур 4375 и 5012 значительных изменений в структуре нефти не наблюдали. Нефть со стенок не смывалась. Поскольку культура преимущественно была сформирована в пленку, мутность среды была невысока.

 

Результаты культивирования на шейкере

 

Накопительная культура 4737, полученная при минерализации 55 г/л демонстрировала значительную визуально оценимую деструкцию нефти. Нефть хорошо смывается со стенок. Существенная часть нефти была представлена в дисперсное состояние. Наблюдается значительное помутнение среды. Культура светло-коричневого оттенка (Рисунок 2).

 

 

Рисунок 2. Накопительная культура 4737, полученная при минерализации 55 г/л (Слева – опытный вариант, справа – контрольный). Инкубирование в течение 7 суток при 40 ℃

 

 

Накопительная культура 5012 имела слабую мутность бежевого цвета, нефть хорошо смывалась со стенок колбы. В среде наблюдалась мелкая

дисперсия светлых оттенков. На поверхности среды отмечались сильно деградированные остатки нефти. (Рисунок 3).

 

 

Рисунок 3. Накопительная культура 5012, полученная при минерализации 55 г/л (Слева – опытный вариант, справа – контрольный). Инкубирование в течение 7 суток при 40 ℃

 

 

Накопительная культура 4375 имела светло-коричневый цвет. Нефть хорошо смывалась со стенок. В среде отмечались крупные остатки деградированной нефти. Среда имела существенную мутность. Наличие мелкодисперсной нефти не отмечалось (Рисунок 4).

 

 

Рисунок 4. Накопительная культура 5012, полученная при минерализации 55 г/л (Слева – опытный вариант, справа – контрольный). Инкубирование в течение 7 суток при 40 ℃

 

 

Микроскопирование образцов

Образец 5012. При микроскопировании наблюдаются кокки и короткие, прямые палочки.

Образец 4737 на 20 г/л. Наблюдаются короткие, прямые, неподвижные палочки; кокки; подвижные короткие палочки; длинные и изогнутые палочки; короткие, толстые, сдвоенные палочки.

Образец 4375. Наблюдаются кокки.

Образец 4737 на 55 г/л. Наблюдаются прямые палочки; кокки; длинные, тонкие, прямые палочки.

 

Результаты пересева

Наиболее активными культуры (4737 на 20 г/л и 55 г/л, 4375 на 55 г/л) были пересеяны на чистые жидкие питательные среды с нефтью с целью более эффективной концентрации УОБ.

Образец 4737 на 55 г/л. Нефть практически полностью смывалась со стенок колбы, остатки присутствовали в среде в виде мелкой дисперсии. Среда светло-коричневого цвета.

Образец 4737 на 20 г/л. Нефть практически полностью смывалась со стенок колбы. При взбалтывании в среде наблюдается мелкая дисперсия нефти. Среда темно-коричневого цвета. На поверхности среды наблюдаются комки тяжелых фракций нефти.

Образец 4375 на 55 г/л. Нефть практически полностью смылась со стенок колбы. Среда коричневого цвета. Комков на поверхности среды не наблюдается. Нефть в виде мелкой дисперсии растворена в среде.

Образец 5012. Нефть плохо отмылась от стенок. Наблюдается слабое помутнение среды. Нефть крупными комками распределена на поверхности среды.

 

Результаты посева на плотные питательные среды

Посев произведен методом серийных разведений. Культуры выедали нефть в виде зон просветления.

Образец 4375 (II) на 55 г/л. На чашках отмечалось появление зон просветления на нефти. Кроме того, сплошным газоном выросли мелкие прозрачные колонии. Наблюдаются мелкие, коричневые колонии округлой формы с ровным краем.

Образец 4737 (II) на 20 г/л. Отмечались выеденные островки на нефти. Видны мелкие, прозрачные, круглые колонии.

Образец 5012 (II) на 55 г/л. Наблюдалось формирование сплошного газона мелких, прозрачных колоний. Также присутствовали колонии светло-коричневого цвета в малых количествах и колонии, похожие на пузырьки на нефти.

 

Выделение чистой культуры

Из накопительной культуры 4375 выделили мелкие колонии светлых и темных оттенков, округлой формы с ровным краем.

Из накопительной культуры 5012 выделили мелкие колонии темных оттенков, округлой формы с ровным краем. При микроскопировании выделенных чистых культур наблюдали ветвящиеся, палочковидные и нитевидные бактерии (Рисунок 5).

 

 

Рисунок 5. Колонии чистых культур штамма 4375 (слева), нитчатые и палочковидные клетки в световом микроскопе с фазово-контрастным устройством при увеличении х1000 (справа)

 

 

Результаты спектрометрического анализа состава нефти

Посредством ИК-спектроскопического исследования показано, что в анализируемых образцах присутствуют ароматические углеводороды, нафтены, изо- и н-парафины, также серо- и кислородсодержащие гетерокомпоненты. Содержания выявленных групп соединений определялись с помощью спектральных коэффициентов.

Согласно полученным данным, наиболее интенсивные полосы поглощения наблюдаются при 1304, 1377, 1468 и 1600 см-1. Интенсивные полосы поглощения при 1377 и 1468 см-1 относятся к валентным деформационным колебаниям СН2- и СН3- групп в парафиновых и циклопарафиновых углеводородах, и характеризуют степень разветвленности парафинов. Также отмечено наличие высококонденсированных сильнозамещенных ароматических структур (2981, 1600 см-1), в том числе с короткоцепочечными алкильными заместителями (720 см-1), и насыщенных фрагментов (2980, 1468 и 1377 см-1). Наличие пиков с максимумами при 2980 и 2870 см-1 демонстрирует наличие соединений с алкильными заместителями (–СН3, –СН2) (Рисунок 6).

 

 

Рисунок 6. ИК-спектры нефти месторождения Узень, экстрагированной из накопительных культур 4737/2, 4737/52 и 4737/53. Контроль – стерильная нефть. Инкубирование в течение 7 суток при 40 ℃

 

 

Необходимо отметить отсутствие интенсивности полос валентных колебаний групп С–О–С и С–ОН в области 1000…2000 см-1 и карбонильных групп в области 1600 см-1. Кислородсодержащие соединения в области спектров 1100…1300 см-1 и ароматических структур при волновом числе 1030 см-1 не фиксируются в изучаемых спектрах.

Особенностью ИК-спектров образцов является достаточно высокая интенсивность полос поглощения в области 3000...2800 см-1, отвечающих колебаниям связей в функциональных группах О–Н, N–Н, С=О, S=O, что указывает на фрагменты фенола, карбазола, карбоновых кислот и сульфоксид (Таблица 2).

На основе доступных литературных данных [10-11] можно сделать вывод о том, что отношения оптических плотностей основных полос поглощения являются объективными и информативными показателями для образцов нефти. В ходе исследования были определены следующие показатели: ароматичность С1=D1600/D721, окисленность С2=D1465/D1705, осерненность С3=D1036/D1465, алифатичность и разветленность, соответственно С4=(D721+D1377)/D1600 и С5=D1377/D1465. Коэффициенты С1 и С4 характеризуют соотношение ароматических и н-парафиновых углеводородов, С5−степень разветвленности парафиновых цепей углеводородов, т.е. строение парафиновых фрагментов (Таблица 3).

По данным табл. 2-3 видно, что распределение ароматических фрагментов в исследуемых пробах нефти неравномерны. Исследуемые образцы обогащены ароматическими соединениями, концентрированными циклановыми би-, три- и полициклическими структурами. Отмечаем, схожесть по структурному составу бициклических УВ в пробах К и 4737/53. В образце №4375/5 бициклические ароматические УВ отсутствуют. Трициклические ароматические УВ при соотношении оптических плотностей близки образцы №К, №4737/2 и №4737/52. Среди исследуемых образцов сумма фенантреновых ароматических УВ выше в образце 4737/53 и значительно ниже в 4375/5. Распределение суммы полициклических ароматических УВ также равномерны: близкие значения у образцов 4737/2, 4375/5 и 4737/53, низкие у образцов К и 4737/52.

 

 

Таблица 2.Содержание структурных групп в нефти, экстрагированной из опытных и контрольных образцов

 

Спектральные коэффициенты			Значения
			К	4737/2	4375/5	4737/52	4737/53
Ароматические УВ	нафталины	1610/720	0,070	0,085	0,000	0,079	0,081
		1610/1460	0,012	0,017	0,000	0,012	0,017
		875/720	0,091	0,090	0,000	0,110	0,038
		875/1460	0,015	0,018	0,000	0,017	0,008
		1030/1460	0,010	0,016	0,000	0,017	0,004
		875/750	0,625	0,129	0,000	0,572	0,063
	фенантрены	815/750	0,097	0,124	0,015	0,122	0,081
		815/1460	0,016	0,025	0,004	0,018	0,017
		815/875	1,067	1,375	0,000	1,108	2,133
	полициклические	750/720	0,145	0,697	0,682	0,192	0,605
		750/1460	0,024	0,142	0,192	0,029	0,126
нафтены	циклогексан	970/720	0,073	0,085	0,000	0,097	0,035
		970/1460	0,012	0,017	0,000	0,015	0,007
степень разветвленности алканов		1380/1465	0,060	0,073	0,054	0,062	0,068
алифатичность		(720+1380)/1600	19,431	15,868	0,000	17,767	16,469
Серосодержащие соединения	C–S-связь	1080/720	0,079	0,164	0,000	0,132	0,030
		1080/1460	0,013	0,034	0,000	0,020	0,006
	сульфоны	1160/720	0,115	0,164	0,021	0,139	0,071
		1160/1460	0,019	0,034	0,006	0,021	0,015
		1310/720	0,366	0,355	0,193	0,410	0,327
		1310/1460	0,060	0,073	0,054	0,062	0,068
осерненность		1030/1465	0,010	0,016	0,000	0,017	0,004
С=О связь		1700/1460	0,000	0,009	0,000	0,000	0,000

 

Наименьшее содержание ароматических УВ отмечены у образца №4375/5, высокие у образца №4737/53 и близкие у образцов №К, №4737/2 и №4737/52.

По результатам изучения структурно-групповых составов отмечено присутствие нафтенов в виде циклоалканов. Состав и концентрация нафтенов в исследуемых образцах распределены неравномерно. Наблюдается отсутствие их в образцах №4375/5, высокие концентрации и близкие значения в образцах №4737/2 и №4737/52.

 

 

 

 

Таблица 3. Характеристика образцов нефти

 

Образец	Спектральные коэффициенты
	С1	С2	С3	С4	С5
	ароматичность	окисленность	осерненность	н-парафины	разветленность
	D1600/D720	D1710/D1465	D1030/D1465	(D720+D1380)/D1600	D1380/D1465
К	0,070	0,000	0,010	46,397	0,373
4737/2	0,085	0,009	0,016	35,500	0,415
4375/5	0,000	0,000	0,000	0,000	0,445
4737/52	0,079	0,000	0,017	46,517	0,407
4737/53	0,081	0,000	0,004	37,719	0,424

 

 

Все исследуемые образцы содержат серородсодержащие гетерокомпоненты, которые также распределены неравномерно. Концентрации серосодсодержащих гетерокомпонентов таких как сульфоны, меркаптаны и тиофены равномерно распределены во всех образцах, кроме 4375/5.

Полученные данные о спектрах подтверждают отсутствие окисления. Однако, незначительная концентрация наблюдается в пробе №4737/2. Данное явление относится к степени окислительных изменений в её составе, которая может быть вызвано воздействием кислорода или других окислительных процессов и реагентов.

 

ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день исследования ориентированные на решения экологических проблем относятся к числу актуальнейших направлений научного познания.

В настоящей работе исследованы загрязненные нефтью образцы грунта, которые имели плотную комковатую структуру темнокоричневого цвета, густо пропитанную тяжелыми фракциями нефти. Образцы грунта были отобраны в местах, где происходят периодические свежие разливы нефти. Образцы характеризовались высокой минерализацией, что объясняется особенностями климата и гидрогеологией региона. Помимо исторических предпосылок на минерализацию образцов может влиять вторичное засоление почв, когда в результате разлива нефти в почву попадает и морская вода, используемая для поддержания пластового давления при добыче. Так, образец 4737, который характеризовался большей минерализацией может свидетельствовать о том, что разлив добываемых жидкостей (нефти и морской воды) в месте отбора данного образца происходил длительное время или с большей частотой, следовательно, и остатки нефти в данном образце более застарелые или содержатся в большем количестве. Высокая минерализация и значительное содержание высокомолекулярных, токсичных и труднодеградируемых соединений нефти резко сокращает спектр живых организмов способных выжить и адаптироваться в описанных условиях.

Микробиологическими методами получены 4 накопительные культуры УОБ, которые обладали разной активностью окисления нефти. Визуально все культуры способствовали значительному изменению структуры нефти по истечении 7 суток при 40 ℃ по сравнению с контрольным образцом из накопительных культур получено 3 чистые культуры нефтеокисляющих бактерий ветвящейся палочковидной и нитевидной формы. Из накопительной культуры 4375 было получено 2 штамма УОБ. Из накопительной культуры 5012 – 1 штамм. Новые штаммы в дальнейшем предстоит идентифицировать и более детально исследовать их физиологические и биохимические особенности.

Остатки частично деградированной нефти были экстрагированы из накопительных культур и после предварительной подготовки проанализированы методом ИК-спектрометрии. Анализ показал, что наибольшая углеводородокисляющая активность характерна для культуры 4375/5 выращенной при минерализации 55 г/л при 40℃. Нефть, экстрагированная из этого образца не содержала нафталинов, нафтенов и алифатических фракций, что свидетельствует об их полном окислении УОБ. Также отмечаются значительные изменения во фракциях серосодержащих соединений и фенантренов, которые только частично подверглись бактериальному окислению.

Накопительная культура 4737 (были получены несколько вариаций этой культуры – 4737/2, 4737/52, 4737/53, выращенные при разной минерализиции) не показала существенной активности. Незначительные изменения отмечались только во фракциях нафталинов и серосодержищих соединений.

Известно, что разветвлённые изопарафины имеют более сложную структуру, включают боковые УВ цепи, которые отличаются от линейных парафинов. Разветвленная структура этих соединений делает их менее доступной для ферментных систем УОБ, и, как следствие, остаются неокисленными.

Таким образом, в работе получены активные накопительные культуры галофильных и умеренно термофильных УОБ, характеризующиеся высоким биотехнологическим потенциалом, способные окислять широкий спектр углеводородов, в том числе высокомолекулярные полициклические и серосодержащие соединения, а также новые штаммы галофильных УОБ, потенциал которых предстоит исследовать в дальнейшей работе.

About the authors

Dinara Maksut

Author for correspondence.
Email: dinara.maksut.97@gmail.com
Kazakhstan

Salimat Bidzhieva

Email: s.bidzhieva@kmge.kz
ORCID iD: 0000-0002-7599-114X

Miua Bissenova

Email: M.Bisenova@kmge.kz

Yerbolat Ayapbergenov

Email: E.Ayapbergenov@kmge.kz

Valentina Sabaldash

Email: v.sabaldash@kmge.kz

References

Supplementary files